细胞固定化方法对酶活稳定性的影响

朱敏捷 冯 超

(南京臣功制药股份有限公司 210038)

[摘 要]本文以大肠杆菌为转化菌，研究了海藻酸钠包埋法细胞固定化技术，初步探讨了细胞固定化方法对产天冬氨酸酶活稳定性的影响。将固定化细胞放置于不同条件下保存, 对比研究保存前后的酶活力，结果表明：海藻酸钠浓度4%，细胞浓度5%,温度40℃时保存的固定化细胞酶活稳定性最高。

[关键词]固定化细胞，天冬氨酸，海藻酸钠，大肠杆菌

中图分类号:TQ920 文献标识码:A 文章编号:1009-914X(2014)17-0272-02

[Abstract]The characteristics of the sodium-alginate immobilized cell was investigated and some important factors influencing it’s stability ofenzymatic activity were analyzed. We still have a study on the enzymatic activity of immobilized cell under different conditions saved. The resultsshowed that the optimal condition of the stability of enzyme activity of immobilized cell was 4 % sodium alginate and 5% Escherichia coli biomassat 40℃.

[Key words]Immobilized cell, Aspartic acid, Sodium alginate, Escherichia coli

1 前言

利用物理或化学的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种技术称之为细胞的固定化，该细胞称固定化细胞[1]。由于该技术既不需要把酶从细胞中提取出来,又不需要加以纯化,因而酶活性损失小。研究和应用表明,固定化微生物技术有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、处理设备小型化等优点[2]。尽管目前还局限在研究阶段，但细胞固定化技术在工业生产的各方面都显示出了广阔的前景，而且其应用范围超出食品加工、轻化工业和制药业，现已扩展到化学分析、环境保护、能源开发等领域。发达国家采用细胞固定化技术制作微生物接种剂接种土壤,并显示出良好的应用前景。国内利用固定化细胞技术生产啤酒和化学试剂等也已获得成功[3]。，由此可见，将来由固定化细胞和酶所构成的具有高效、低耗、无公害、长寿命、安全、自动和连续的生物反应器将逐渐代替传统的发酵工艺和有机合成工艺。固定化细胞多为球型颗粒，必需具有生命活力，因此维持细胞适度的生长和繁殖等尤为重要，如果生长、繁殖过度，容易使细胞泄漏出来，增加扩散障碍，破坏固定化细胞的载体或基质[4]。固定化细胞的微环境对固定化细胞活力的发挥有很大的影响。固定化细胞的呼吸、生长速度、扩散速率以及代谢作用等，将随着细胞浓度的增加而降低，但其抗拒不良外界环境条件的能力通常要比游离细胞高[5]。从理论上讲，任何一种限制细胞自由流动的技术都可以用于细胞的固定化，但并非一切能够应用可溶性酶的地方都可以用固定化细胞来代替。使用固定化细胞的过程中，pH值、温度、底物、载体等都对它的活力、应用效率有影响[6]。

目前制备固定化细胞的方法有吸附法，包埋法，共价结合法等，本文主要是用包埋法：将细胞悬浮于一定浓度的海藻酸钠溶液中[7]，再与适当浓度的氯化图4 保存温度对固定化细胞酶活稳定性的影响注：保存温度表示为 ■，40℃；▲，50℃；◆，70℃）钙溶液接触，则形成海藻酸钙凝胶[8]，研究固定化方法对产天冬氨酸酶活稳定性的影响，通过不同的固定化方法对固定化细胞酶活力的影响，测得固定化方法对产天冬氨酸酶活稳定性的影响；同时通过对不同浓度的载体及细胞浓度对固定化细胞酶活力的影响，继续进行研究对比，从而得出最高的酶活力；在载体和浓度都相同的情况下，再次通过对pH，温度等的不同对固定化细胞酶活稳定性的影响，研究固定化方法对产天冬氨酸酶活稳定性的影响。

2 实验材料与仪器

2.1 实验材料

菌种：大肠杆菌

2.2 仪器

TE612-L电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；MC-23高压灭菌锅（上海精密科学仪器有限公司）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）；DL-2D定时数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；PHS-3CpH计（上海三信仪表厂）。

3 实验方法

3.1 细胞的培养

3.1.1 斜面培养基

斜面培养基组成（1L）：牛肉膏 10g，蛋白胨 10g，富马酸 10g，葡萄糖0.5g，琼脂20g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 5g。用浓氨水调pH至7.0～7.2，分装于试管中，120℃灭菌20分钟，冷却后放置成斜面。培养条件：接种后置于37℃恒温培养箱中培养16～24小时，放置在冰箱中保存。

3.1.2 液体培养基

液体培养基组成（1L）：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 3.0g，富马酸 8.0g，MgSO4·7H2O 0.6g，NaCl 1.2g。用浓氨水调pH至6.8～7.0，每250mL锥形瓶中分装100mL培养液。培养条件：用已培养16～24小时的新鲜斜面大肠杆菌接种，摇床转速150r/min，38℃培养16小时。

3.1.3 平板培养基

细胞生长培养基成分（1L）：牛肉膏 10g，蛋白胨 10g，富马酸 5g，NaCl5g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g。用氨水调pH至6.9～7.2后加入22g剪碎的琼脂条。121℃灭菌20min，稍冷却后倒平板。培养条件：用接种针刮取培养的斜面大肠杆菌在平板上Z型划线接种，划线尽量多，在培养箱中36～37℃培养16～24小时。

3.2 固定化细胞的制备

3.2.1 菌悬液制备

在已培养了16～24小时的平板上用药匙轻轻刮取0.5g大肠杆菌细胞，加入10ml蒸馏水，配置成5%的大肠杆菌菌悬液，并用少量的蒸馏水洗下平板上的剩余大肠杆菌细胞。

3.2.2 固定化细胞的形成

向大肠杆菌菌悬液中加入3%的海藻酸钠溶液10ml，搅拌混匀，用恒流泵以均匀的转速逐滴滴入100ml 0.2mol/L CaCl2溶液中，边滴边用磁力搅拌器慢慢搅拌，即成珠状颗粒，继续放置于CaCl2溶液中浸泡2小时。

3.2.3 戊二醛交联法

将已经固定化的细胞用0.05mol/LCaCl2溶液配制的50ml 0.05%的戊二醛溶液浸泡2小时，然后过滤、洗涤、抽干，得到用戊二醛交联的固定化细胞。

3.2.4 固定化细胞的保存

将已经固定化的细胞放在0.2mol/LCaCl2缓冲液中放置在70℃的恶劣环境里保存，每隔24小时测定一次固定化细胞的酶活力，观察其酶活稳定性。

3.3 酶活力的测定

3.3.1 转化率的测定

取2g固定化细胞过滤，洗涤，抽干后放入250ml三角瓶中，加入10%的富马酸氨溶液100ml，包扎好瓶口放入摇床转化1小时，温度控制在37℃，转速控制在80转/分。取还未开始转化的试样溶液0.5ml放入150ml三角烧瓶中，加入25ml 10%的硫酸，混匀后放入水浴锅中加热到70～80℃，用0.1N高锰酸钾滴定，记滴定体积为V0；取转化后的试样溶液0.5ml，按上述方法滴定，记滴定体积为V1。转化率的计算：转化率=（V0- V1）/ V0*100%每隔24小时，从保存在缓冲液中的固定化细胞中取2g放入250ml三角瓶中，加入10%的富马酸氨溶液100ml，包扎好瓶口放入摇床中转化1小时，依照上述方法测定其转化率。

3.3.2 酶活力的定义

酶活力一般以单位来计算，一个酶活力单位即在一定条件下，一定的时间内将一定量的底物溶液转化为产物所需的酶量。

3.3.3 酶活力计算

本文定义1小时反应1g富马酸为一个酶活力单位，记为1U。计算出：酶活力=1g*(VO-V1) / VO*100%/1h/0.5m（l U/g）=2*( V0- V1) / V0*100%。

3.4 天然细胞的酶活力测定

配置10%的富马酸按溶液作为底物溶液，按培养液与底物溶液的比为1：5的量加入培养液，水浴锅恒温50℃转化1小时。取反应底物富马酸氨溶液0.2mL放入250mL三角烧瓶中,加入35mL 30﹪ 的硫酸,加热至70～80℃,用0.1mol/L高锰酸钾滴定，记滴定体积V0。取反映一段时间后的溶液0.2ml,依上述方法滴定，记滴定体积为V1。计算出天然游离细胞的酶活力。

4 结果与分析

定义保存前的初始酶活力为100%，推算出一定条件下保存后的酶活力比例值，作出曲线图。

4.1 戊二醛交联法对固定化细胞酶活稳定性的影响

用4%的海藻酸钠包埋5%的大肠杆菌细胞菌悬液，观察在恶劣环境中保存后的固定化细胞酶活力损失情况，将用戊二醛交联的固定化细胞作为对比进行试验，得出戊二醛交联法对固定化细胞酶活稳定性的影响。结果如图1，由图可知，经戊二醛交联过的固定化细胞在恶劣环境中保存后，酶活力损失率较大，酶活稳定性明显下降。

4.2 海藻酸钠浓度对固定化细胞酶活稳定性的影响

取0.5g大肠杆菌湿菌体用不同浓度海藻酸钠溶液包埋，观察恶劣环境中保存后其酶活损失情况，得出不同的海藻酸钠浓度对固定化细胞酶活稳定性的影响。结果如图2，由图可知，随着海藻酸钠溶液浓度的增加，固定化细胞的酶活损失率先下降后增大，在海藻酸钠浓度为4%时，固定化细胞酶活稳定性最高。

4.3 细胞浓度对固定化细胞酶活稳定性的影响

用浓度为4%的海藻酸钠包埋不同浓度的大肠杆菌细胞菌悬液，观察在恶劣环境中保存后其酶活损失情况，得出不同的大肠杆菌细胞浓度对固定化细胞酶活稳定性的影响。结果如图3，由图可知，随着细胞浓度的增加，固定化细胞酶活损失率增大，在细胞浓度为5%时，固定化细胞酶活稳定性最高。

4.4 保存温度对固定化细胞酶活稳定性的影响

取0.5g大肠杆菌湿菌体用4%海藻酸钠溶液包埋，将固定化细胞放在缓冲液中保存，并存放在不同的温度环境里，每隔24小时测定一次固定化细胞的酶活力，观察其酶活损失情况，得出不同的保存温度对固定化细胞酶活稳定性的影响。结果如图4，由图可知，随着保存温度的增加，细胞所处的环境越发恶劣，固定化细胞酶活损失率增大，在40℃时保存可使固定化细胞酶活稳定性最高。

4.5 保存时间对固定化细胞酶活稳定性的影响

取0.5g大肠杆菌湿菌体用4%海藻酸钠溶液包埋，放置在70℃恶劣环境中保存，每隔24小时测定一次固定化细胞的酶活力，观察其酶活损失情况。结果如图5，由图可知，随着保存时间的延长，固定化细胞酶活损失率逐渐增大，因此，想要保证固定化细胞的酶活力最高应尽量减短保存时间，以便利用最大的酶活力。

5 结论

用包埋法固定大肠杆菌有多种载体，但鉴于其包埋后的效果以及制作过程的难易程度，海藻酸钠包埋法最为合适，不仅在固定过程中不用涉及过多程序，而且海藻酸钠固定大肠杆菌所需要的环境也比较适中。通过不同的固定化条件的选择及不同的固定化细胞保存条件，测得固定化方法对产天冬氨酸酶活稳定性的影响，可知在保存固定化细胞的过程中，其酶活受自身及外界因素的影响逐渐下降。固定化细胞在经戊二醛交联后酶活稳定性下降；海藻酸钠浓度为4%时酶活稳定性高于浓度为3%和5%时的酶活稳定性；细胞浓度为5%时的酶活稳定性高于浓度为10%和15%时的酶活稳定性；在保存温度为40℃时的酶活稳定性高于温度为50℃和70℃时的酶活稳定性。提高固定化细胞酶活利用率可从以下四方面进行研究：减少固定化过程中酶活性的损失，改善固定化酶活性的通透性，提高固定化酶活性的机械性能，提高固定化酶活性的稳定性。而提高固定化细胞酶活的稳定性对于工业生产尤为重要，可通过固定化条件的选择及固定化细胞的保存条件的改变寻找最佳组合方式来实现。

参考文献

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