咪唑安定对豚鼠噪声性聋的保护作用

随着现代医学的发展，医用电钻在耳科手术中应用越来越广泛，但耳科电钻噪声引起的内耳听力损伤仍未引起足够的重视。早在1976年KYLEN和ARLINGER通过人的颞骨和尸体颅骨研究证实耳科电钻在术侧耳蜗的噪声为100dB，这种噪声可以导致高频感音神经性听力下降。噪声可对人的听觉系统产生特异的损伤作用，导致听阈升高，严重的则引起噪声性聋。噪声对听觉系统的损伤除造成代谢性损伤外，同时产生机械损伤，两者均导致大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，ROS在噪声引起的耳蜗损害中起着十分重要的作用[1]。ROS清除剂能减轻噪声引起的听力损害[2]。CHUNG[3]研究表明,全身麻醉药异氟醚、氟烷、戊巴比妥能够对小鼠噪声引起的听力损害起到保护作用，推测其机制可能与活性氧的产生减少有关。本研究通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和耳蜗中ROS含量来研究咪唑安定对噪声性聋的防护作用及其可能作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组

　　选用耳廓反射正常的健康雄性杂色豚鼠40只，体重250～300g，随机分为正常对照组(C组)、咪唑安定组(M组)、生理盐水组(S组)和噪声性聋组(D组)，每组10只。正常对照组不接触噪声，只注射咪唑安定；咪唑安定组接受噪声暴露且注射咪唑安定；生理盐水组接受噪声暴露，注射生理盐水；噪声性聋组单纯接触噪声。

　　1.2  噪声条件

　　自制噪声箱，为自由声场的混响箱，背景噪声<40dB SPL(A)。采用特制动物笼，将每只豚鼠分隔开。噪声箱的两个对角有两个扬声器，特制动物笼放置在两个扬声器之间，与每个扬声器的距离约为40cm。扬声器与纯音听力计相连(丹麦产DANPLEXDA74)，由纯音听力计发出中心频率为4kHz的倍频程连续噪声，校准后强度为100dB SPL，且使每只动物所在位置噪声基本一致。咪唑安定组、生理盐水组和噪声性聋组动物每天给与3h连续噪声，持续3d。正常对照组不接触噪声。

　　1.3  给药方法

　　咪唑安定组于噪声暴露前24h、噪声暴露前即刻及噪声暴露中1h肌肉注射咪唑安定0.1mg/kg(购自江苏恩华药业有限公司)。正常对照组给予注射咪唑安定，其时间与剂量同咪唑安定组；生理盐水组在相同时间肌肉注射等体积的生理盐水。

　　1.4  听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)阈测试

　　所有动物均于噪声暴露前及暴露后立即测ABR阈值(丹麦产Keypoint)。10g/L氯胺酮(0.5mg/kg)腹腔注射麻醉后，将气导耳机紧贴豚鼠耳廓，分别测定左右耳，记录电极置于豚鼠颅顶，参考电极置于刺激侧耳垂，地线绑于足部。刺激声为短声(click)，强度范围为0～120dB SPL，重复率为19.4次/min，平均叠加次数1000次，滤波带宽100～5000Hz。每只豚鼠以能引出明确的可重复III波的最小刺激声压级作为阈值。

　　1.5  血清SOD活性和MDA含量测定

　　在噪声暴露前和噪声暴露第3天处死前，取豚鼠血约1mL，3000r/min离心30min，取血清-80℃冻存，待测。使用MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，按操作说明测定血清SOD活性和MDA含量。
　
　　1.6  耳蜗组织ROS含量的测定

　　噪声暴露第3天ABR测试后，立即将所有豚鼠断头处死。迅速取出双侧听泡，置于4℃ PBS液中，在显微镜下去除蜗壳，取出基底膜连带蜗轴，立即置液氮中，24h后于-80℃冰箱保存，用于耳蜗组织ROS含量的测定。豚鼠断头处死到将耳蜗组织液氮冷冻的时间平均为15min，每只之间相差不超过3min。

　　1.6.1  耳蜗组织匀浆液的制备

　　自-80℃冰箱取出保存的豚鼠双侧耳蜗，置于微型玻璃匀浆器中，先加入0.5mL匀浆介质，于冰上研磨15min后倒入1mL的EP管中，再用0.5mL匀浆介质冲洗玻璃匀浆器后倒入EP管中，于低温、4000r/min离心15min，取上清用于ROS含量的测定。
　1.6.2  耳蜗组织ROS含量测定 医学类论文发表

　　使用ROS测定试剂盒测定(南京建成生物工程研究所提供)。最佳取样量定为2%，抑制率为21.35%，符合抑制率在20%～50%的要求。将耳蜗组织匀浆用生理盐水稀释成20mL/L，取0.2mL测定。

　　1.7  统计学处理

　　数据处理应用SPSS13.0 统计软件包，所有数据经过正态性检验符合正态分布，数据以±s表示。噪声暴露前后组内比较采用配对t检验分析，组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结 果

　　2.1  各组ABR阈移

　　噪声暴露前，4组ABR阈值之间比较均无显著性差异(P>0.05)。

    正常对照组和咪唑安定组动物噪声暴露后与噪声暴露前ABR阈值无显著性差异(P>0.05)，而生理盐水组、噪声性聋组噪声暴露后ABR阈值明显高于噪声暴露前(P<0.01)。噪声暴露后，咪唑安定组的ABR阈移明显低于生理盐水组和噪声性聋组(P<0.01)，正常对照组的ABR阈移也显著低于生理盐水组和噪声性聋组(P<0.01)。正常对照组和咪唑安定组之间、生理盐水组和噪声性聋组之间ABR阈移的差异均无显著性(P>0.05，表1)。表1  各组豚鼠的ABR阈移（略）与噪声暴露前比较，*P<0.01；与咪唑安定组比较，#P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.01。

　　2.2  血清SOD活性和MDA含量变化

　　生理盐水组和噪声性聋组在噪声暴露后血清SOD活性明显下降(P<0.05)，血清MDA含量则显著增高(P<0.01)。咪唑安定组在噪声暴露后同样出现血清SOD活性下降和MDA含量升高，但其幅度明显小于生理盐水组和噪声性聋组(P<0.05)。正常对照组血清SOD活性和MDA含量没有明显变化(表2、表3)。表2  各组豚鼠血清SOD活性的变化（略）与噪声暴露前比较，*P<0.05, **P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.05；与噪声性聋组比较，△P<0.05。表3  各组豚鼠血清MDA含量的变化（略）与噪声暴露前比较，**P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.05；与噪声性聋组比较，△P<0.05。

　　2.3  各组豚鼠耳蜗ROS含量的变化 医学类论文发表

　　咪唑安定组的ROS含量低于生理盐水组和噪声性聋组，正常对照组的ROS含量也低于生理盐水组(P<0.05)。正常对照组和噪声性聋组之间、生理盐水组和噪声性聋组之间ROS含量比较无显著性差异(P>0.05，表4)。表4  各组豚鼠耳蜗ROS含量（略）与咪唑安定组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05。

　　3  讨 论

    ROS指生物体内氧的某些代谢产物及其衍生的含氧的自由基。需氧生物体内均可产生活性氧，其具有独特的生理作用。细胞有许多抗氧化机制，可以分为酶类和非酶类物质。酶类物质包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)；非酶类物质有很多，包括维生素C、谷胱甘肽(GSH)、维生素E和甘露醇等。正常人体内ROS的产生与CAT、GSH-Px、SOD等保护酶构成的内源性防御系统维持着动态平衡。只有当ROS的产生与防御系统的一系列酶的清除作用失衡，ROS的产生超过了机体的防御能力时，才会对机体造成损害。

    噪声性聋的机制是一个复杂的多因素过程,研究认为包括机械性、代谢性和血管性原因。耳蜗是有氧代谢非常旺盛的器官，产生大量ROS，容易受到ROS的氧化损伤。声音的过分刺激能导致酶和代谢产物在毛细胞中的再氧化，产生活性氧产物。噪声可造成氧自由基对组织的损伤,直接破坏细胞膜成分,还可通过生物膜及亚细胞器损伤,在末梢组织造成广泛损害。脂质过氧化物还可抑制前列腺素(PGI2)的合成,引起血管收缩和凝血,进一步加重内耳缺血,致组织细胞变性坏死[4]。近几年来，已有利用维生素E与维生素C的抗氧化机制来预防噪声性聋的相关报道[5-6]。

    自由基对细胞的损害在于攻击细胞膜脂质产生过氧化反应，MDA则是自由基攻击生物膜引发脂质过氧化反应的产物，其含量可反映脂质过氧化的程度，间接反映细胞受自由基攻击和损伤的程度。体内自由基的清除依靠SOD等抗氧化酶系统，测定SOD活性可反映组织抗脂质过氧化能力。

    咪唑安定作为一种新型的非巴比妥类静脉麻醉药已广泛应用于临床。咪唑安定除了具有麻醉镇静作用外，由于其结构上与内源性抗氧化物维生素E相近，在生物体中作为供氢体与自由基反应生成苯氧基而清除自由基，具有一定的抗氧化作用。其抑制自由基介导的脂质过氧化作用可能是主要的抗氧化机制[7]。吴新文等[8]研究发现临床剂量的丙泊酚和咪唑安定具有清除自由基的作用，增加机体抗氧化能力。咪唑安定能降低组织细胞代谢率[9] ，经肝微粒体羟化作用而代谢，可消除体内的·OH，可使由·OH引发的脂质过氧化反应减轻。医学类论文发表

    本实验发现噪声暴露后豚鼠血清氧自由基反应代谢产物MDA含量明显升高，提示噪声环境下豚鼠血中自由基生成增加，势必影响到耳蜗组织中MDA含量，豚鼠听力受损程度与自由基对内耳的氧化损伤密切相关。同时，咪唑安定组血清SOD活性高于生理盐水组和噪声性聋组，说明咪唑安定可减少氧自由基生成，提高SOD活力，对自由基氧化引起的听力损害有预防和治疗作用。

    ABR是反映听功能的一项客观指标。本实验的噪声条件可以使听阈提高40dB左右。由本研究结果可看出，长时间的强烈噪声暴露可引起听阈提高；而注射咪唑安定可起到防止听阈提高的作用，注射生理盐水对噪声性聋无预防作用。通过对耳蜗中ROS含量测定，证明咪唑安定有一定的抗氧化活性，可以抵抗体内过多的ROS，对噪声性聋起到预防作用；生理盐水无抗氧化活性，故没有预防噪声性聋的作用。

    本实验证实长时间的强烈噪声暴露能引起听阈提高和耳蜗中ROS含量增高，咪唑安定对噪声性聋有一定的预防作用，噪声性听力损失可能与ROS密切相关。这为耳科手术中使用电钻造成噪声性聋的预防提供了科学依据。目前研究还限于动物实验阶段，咪唑安定在临床应用上的剂量还有待于进一步探讨。