葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的构建及其免疫原性鉴定

支气管哮喘是全球最常见的慢性疾病之一，而过敏性哮喘则是临床上最常见的哮喘类型。过敏性哮喘通常由吸入变应原或食入变应原后诱发。诱发哮喘的物质很多，如花粉、尘螨、霉菌、动物皮毛等，其中葎草花粉是夏秋季最重要的吸入性变应原之一。变应原特异性免疫治疗是唯一针对病因治疗的方法。应用传统粗制变应原提取液进行免疫治疗，需要长疗程多次皮下注射，患者的依从性差，且粗制变应原的成分繁杂，除变应原成分外还含有非变应原成分，可能引起局部和全身过敏反应。变应原核酸疫苗具有持久免疫应答、易标准化、生产应用方便等优点，在过敏性疾病的预防、诊断、治疗上具有很大的潜力和优势。变应原核酸疫苗的构建及应用研究是目前的研究热点之一。本研究构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗并初步评价其免疫学活性，为葎草花粉过敏性哮喘的防治提供了新方法。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　DH5α工程细菌由西安交通大学医学院中心实验室惠赠，pcDNA3.1(-)由第四军医大生物化学教研室惠赠，含目的基因的pTripIEx2-LC2质粒由本课题组实验室保存。T4DNA连接酶，EL0014内切酶(HindⅢ，ER0507)，(EcoRⅠ，ER0277)购自Fermentas公司，Fastfilter Endo-Free Plasmid Maxi Kit(D6926-03) 25 preps购自E.Z.N.A公司。6周龄的雌性BALB/c小鼠由西安交通大学医学院动物实验中心提供并饲养。葎草花粉变应原浸液1/20(g/mL)由西安交通大学医学院第二附属医院变态反应实验中心提供。

　　1.2  pTripIEx2-LC2和pcDNA3.1(-)HindⅢ、EcoRⅠ双酶切

　　小量提取质粒分别测得pTripIEx2-LC2质粒浓度为225.7mg/L，pcDNA3.1(-)质粒浓度为483.6mg/L。用HindⅢ、EcoRⅠ内切酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂回收LC2目的基因片段和pcDNA3.1(-)质粒的大片段。

　　1.3  将LC2目的基因定向插入pcDNA3.1(-)质粒

　　测回收LC2基因片段的浓度为3.6mg/L，pcDNA3.1(-)质粒大片段的浓度为18.3mg/L。用T4DNA连接酶连接，将连接产物命名为pcDNA3.1-LC2，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。

　　1.4  pcDNA3.1-LC2转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

　　应用预冷的无菌吸头从制好的感受态细胞悬液中吸取200μL，并转移到无菌的离心管中。每管中加入10μL DNA，轻轻旋转以混匀，在冰上放置30min。然后，将离心管放入预加温至42℃的循环水中静置90s，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加800μL LB培养基，用水浴加温至37℃，将管转移至摇床上，温育45min，使细胞复苏至表达抗性基因。将已转化细胞转移到氨苄霉素LB固体平板培养基上，置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养。

　　1.5  双酶切鉴定pcDNA3.1-LC2

　　将生长良好的单克隆菌落接种入含5mL氨苄霉素的LB培养基的50mL试管中培养，提取质粒测浓度为382.6mg/L，行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定。

　　1.6  核酸测序鉴定pcDNA3.1-LC2

　　将1mL转化菌液送奥科生物技术有限公司测核苷酸序列。BLAST比对pcDNA3.1-LC2质粒与pTripIEx2-LC2中目的基因有无突变、缺失及目的基因是否存在串连插入等。

　　1.7  pcDNA3.1-LC2免疫原性鉴定

　　6周龄的雌性BALB/c小鼠，体重为(20±2)g，共12只，编号1～12号，用秒表行系统分组的方法随机分为对照组和保护组。每组6只分别标为A、B、C、D、E、F。第1天每只小鼠两后腿股四头肌各肌注7.5g/L布比卡因50μL，第2天对照组同部位多点注射pcDNA3.1(-)质粒100μg(A260，1164mg/L)，保护组同部位多点注射pcDNA3.1-LC2 100μg(A260，909mg/L)。第8天重复第2天各组的操作。第29天将各组小鼠摘眼球处死取血清。
　
　　2  结 果

　　2.1  pcDNA3.1-LC2的双酶切论文发表中心

　　 pcDNA3.1-LC2进行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，将酶切产物琼脂糖凝胶电泳，可见5个克隆的条带基本一致，目的片段大小大致在900bp左右(图1)。
2.2  pcDNA3.1-LC2质粒的测序 
　　构建好的含有葎草花粉主要变应原目的基因的pcDNA3.1-LC2质粒，以T7通用测序引物，由奥科测序公司提供测序结果。BLAST比对结果显示pcDNA3.1-LC2质粒与pTripIEx2-LC2质粒中目的片段无突变、缺失和倒置。

　　2.3  pcDNA3.1-LC2免疫原性的鉴定

　　本实验双向免疫扩散采用梅花斑方式，任何两周围孔与中心孔都组成呈中心对称的正三角形，两底角孔血清抗体浓度差别较大时，高浓度抗体会干扰低浓度抗体。本实验6只小鼠血清浓度的血清抗体没有明显差别，相互之间没有明显干扰。通过预试验检测葎草花粉变应原与小鼠血清反应时域的比例，得知葎草花粉变应原浸液1/20(g/mL)稀释4倍与小鼠血清反应可产生明显的沉淀线。30μL 1/80(g/mL)葎草花粉变应原浸液与30μL pcDNA3.1-LC2免疫血清双向免疫扩散试验结果见图2。
　
　　3  讨 论

    一般认为支气管哮喘是由于外界因素诱发遗传性Th1与Th2细胞免疫失衡导致的Ⅰ型变态反应性疾病[1-2]。Th1与Th2细胞不同的免疫学功能导致不同的免疫反应，Th1细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ，主要活化巨噬细胞，参与细胞免疫。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13和GM-CSF，主要刺激B细胞增殖并产生抗体，诱导肥大细胞和巨噬细胞生长分化和IgE免疫球蛋白的生成，参与体液免疫。具有Th2特异免疫的个体初次接触变应原后Th细胞在IL-4的作用下分化为Th2细胞，诱导B细胞增殖分化为浆细胞产生特异IgE，IgE的Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面FcεRⅠ受体结合，导致机体处于致敏期，当再次接触过敏原时，致敏的肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE与变应原结合引发IgE交联，导致脱颗粒释放组胺、白三烯等炎症介质，引起相应器官组织的病理生理学改变。论文发表中心

    葎草(humulus scandens)俗称“拉拉秧”，主要分布于我国除新疆和青海外的各地区。另外，也见于日本和北美洲各国[3]。近年来葎草属花粉已成为我国及东亚地区夏秋季节花粉症的一个重要致敏原[4-5]。本研究成功构建了葎草花粉主要变应原pcDNA3.1-LC2核酸疫苗，它以松弛型高拷贝质粒PUC为骨架，含有新霉素抗性、氨苄青霉素抗性筛选基因，PUC骨架含有CpG序列非甲基化的CpG六聚体，为5′-嘌呤嘌呤CG嘧啶嘧啶3′，有利于诱导Th1为主的免疫反应[6-7]。带有细菌复制子ori，可以在大肠杆菌中高拷贝的扩增，适于大量制备核酸疫苗，并且含有SV40肉瘤病毒40复制子，GABLER等[8]研究梯牧草主要变应原Phi p 5的核酸疫苗，提示含有病毒复制子的核酸疫苗可以诱发更强的保护性免疫反应。在人体应用这种优化后的核酸疫苗时，仅需毫克级的核酸疫苗即可诱导适当的保护性免疫反应。目的基因位于CMV巨细胞病毒启动子的下游HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点之间。CMV真核启动子与其他启动子PSV、LIR等相比，CMV在各种组织中都能引发下游基因的高水平表达。经BLAST序列分析LC2与拟南芥花粉外壳蛋白GSLTFB91ZE04号基因同源性达80%，用InterProscan软件分析GSLTFB91ZE04号基因编码蛋白为过敏毒素，提示LC2基因编码的蛋白也可能为致敏蛋白。经ORF分析，目的基因片段有一个672bp大小的完整的开放阅读框，编码224个氨基酸。经小鼠动物实验证明葎草花粉主要变应原pcDNA-LC2核酸疫苗能够在小鼠体内表达，能够产生葎草花粉变应原特异性中和抗体，具有良好的免疫原性，为进一步研究葎草变应性哮喘病的防治奠定了基础。

    目前，国内外在尘螨、花粉、乳胶等变应原核酸疫苗的大量研究中，表明核酸疫苗可诱导Th2为主的免疫反应向Th1为主的免疫反应偏移，在动物哮喘模型中，花粉、蜂毒、卵清蛋白、豆类、花生、蟑螂、真菌、乳胶等核酸疫苗能够抑制哮喘动物模型呼吸道炎症反应的产生，而且对气道炎症有一定的治疗作用[9]。核酸疫苗的未来研究方向是要朝着理想疫苗的方向发展，即安全高效的疫苗方向发展。在抗原研究中，新近的研究主要集中在优势表位的筛选和组合，抑制性表位的剔除；在核酸疫苗载体的研究方面，除了现在常用的质粒载体，又出现了病毒载体，因其具有质粒载体所不具有的独特优势，被尝试使用，又因其具有潜在的危险性，处于慎重发展阶段。目前，受到关注比较多的病毒载体系统有痘病毒载体、腺病毒载体等[10-11]。在免疫佐剂的研究中，CpG基序和细胞因子作为核酸疫苗的佐剂的作用得到不断的证实；在免疫方案方面，联合疫苗、多途径联合免疫等显示了良好的应用前景。但是，对核酸疫苗的免疫机制和如何提高免疫水平仍然需要进一步的研究，核酸疫苗在构建以及生产方面还存在需要改进的地方。