N?软脂酰基壳聚糖的制备及其改善靛玉红水溶性的药动学研究

【摘要】  目的 制备N?软脂酰基壳聚糖（PLCS）纳米胶束，改善难溶性药物靛玉红的溶解性与生物利用度。方法 首先使用溶胀的壳聚糖与软脂酸酐在二甲基亚砜溶剂中反应合成水溶性的PLCS，通过IR和1H?NMR表征PLCS的结构；然后用其负载靛玉红，以激光散射和透射电镜检测载药纳米胶束的物理特征,用HPLC法测定其包封率。最后进行载药纳米胶束腹腔注射给药后在大鼠体内的药动学实验,与靛玉红混悬剂对照。结果 合成得到的PLCS能很好地负载并增溶靛玉红，载药率可达10%左右。药动学研究表明，用PLCS载靛玉红后较靛玉红混悬剂的AUC提高了2.21倍，显著提高了靛玉红在大鼠体内的生物利用度。结论 PLCS可作为提高难溶性药物靛玉红生物利用度的有效载体，进而可能改善靛玉红治疗白血病的疗效。

【关键词】  靛玉红 N?软脂酰基壳聚糖 纳米胶束 药动学

从青黛等中药中提取的靛玉红在白血病治疗中已显示出独特的优势，它既能有效破坏白血病细胞，又对正常骨髓无明显抑制作用。然而靛玉红的水溶性很差，不利于被吸收，生物利用度非常低；同时，它对胃肠道黏膜有很强的刺激作用。吴正红等［1］认为可通过增加靛玉红的溶解度以提高其生物利用度，在剂型设计上要以提高靛玉红的溶解度为中心。目前，通过对壳聚糖表面进行修饰并利用其做为药物载体，是新型水溶性制剂研究的前沿阵地［2］。Sirica A E等［3］曾报道壳聚糖本身对白血病癌细胞具有选择性聚集作用，而且壳聚糖及其衍生物对白血病癌细胞也有较强的抑制作用［4］。因此，本文采用壳聚糖分子接枝软脂酰基，制备N?软脂酰基壳聚糖（PLCS）来增溶控释靛玉红，以提高靛玉红的生物利用度和降低其对消化道的毒副作用，并发挥壳聚糖衍生物纳米粒子作为抗白血病药物载体所具备的独特优势。

　　1    材料与方法

　　1.1    试剂、药品与仪器
     
　　壳聚糖（分子量45 kDa，脱乙酰度为95％，上海博奥生物科技公司），软脂酸、乙酐（广州化学厂），HPLC用甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯，靛玉红（自提取，纯度95％以上）。
     
　　LC?10AT 高效液相色谱仪(shimadzu,Japan)， Nicolet 670 FT?IR红外光谱仪(Thermo Nicolet,USA)， Mercure plus 300 MHz 1H?NMR 核磁共振仪（Varian,USA），BI?200SM goniometer激光散射仪(Brookhaven,USA)， JEM?2010电子显微镜(JEOL,Japan)， IEC Micromax Microentrifuge(Thermo Electron corporation,USA)。

　　1.2    PLCS的合成与聚合物结构表征

　　1.2.1    PLCS的合成方法    参考Hirano等［5］的方法:2.0 g（0.012 moL）壳聚糖（脱乙酰度95%）溶解在100 mL 0.1 mol/L的稀乙酸中，再以0.2 mol/L NaOH溶液沉淀，过滤，蒸馏水洗涤到pH值接近7，沥干水分，分散到100 mL二甲基亚砜（DMSO）中，磁力搅拌下升温至60 ℃，缓慢滴加0.024～0.048 moL软脂酸酐，保温反应8 h结束反应，加入丙酮沉淀产物，过滤，滤渣依次用丙酮和乙醚洗涤多次，除去软脂肪酸和软脂酸酐，产物60 ℃下真空干燥，产物的取代度(DS)定义为壳聚糖分子中每100个糖环中所引入的脂肪酰基个数，用酸碱滴定以及1H?NMR法测定。

　　1.2.2    PLCS聚合物结构表征

　　1.2.2.1    FT?IR分析    以KBr压片，用Nicolet 670 FT?IR红外光谱仪测定。

　　1.2.2.2    1H?NMR分析    以Mercure Plus 300 MHz spectrometer核磁共振仪在室温下测定，以氘代DMSO(DMSO?d6)为溶剂（TMS内标），试样质量浓度约为3%。

　　1.2.2.3    空白纳米胶束制备和胶束性能检测    用直接溶解法制备胶束，称取一定量的PLCS置小烧杯中，量取一定体积的二次蒸馏水（经0.5 μm滤膜过滤处理）倒入烧杯中，用普通超声仪震荡3次（每次10 s），可看到PLCS逐渐溶解，除液面有少许泡沫外，溶液基本澄清。再用触点超声仪震荡3次(每次5 s )，此时液面产生大量泡沫，但不久泡沫消散得澄清溶液，即得到PLCS胶束溶液，用光电笔穿透照射溶液，可观察到明显的光路，即溶液有明显的丁达尔现象。
      　　
　　用动态光散射方法测定胶束的水动力学半径( hydrodynamic radii )和聚合物分散度。将按上述方法配制的PLCS水溶液倒入检测池中，以532 nm的激光垂直照射样品池，检测器与入射光的角度为90°。
      　　
　　在以透射电镜（TEM）检测胶束粒子之前，胶束纳米粒子先通过甲胺钨酸盐染色：取按“3.2.1”项的方法配制的PLCS水溶液1?2滴，滴在200目表面镀了碳膜的铜网上，自然干燥5 min后，以滤纸轻轻吸干铜网上的液珠，然后把铜网浸泡在甲胺钨酸盐的缓冲溶液中，染色1 min，再在清水中漂1～2次，室温下晾数分钟，在电镜下观察纳米胶束的粒径和形貌。

　　1.3    靛玉红PLCS纳米胶束的制备与载药量测定
      　　　
　　准确称取多份靛玉红(每份约200 mg)置小三口瓶中，依次倒入15 mL二氯甲烷、10 mL丙酮，磁力搅拌使靛玉红完全溶解，然后加入PLCS(DS 14.  2) 200～1 000 mg,继续磁力搅拌，此时PLCS不溶解，随后缓慢滴加15～30 mL双蒸水，随着双蒸水的不断加入，PLCS逐渐溶胀、溶解并逐渐聚集形成胶束缠绕负载上靛玉红。混合溶液继续搅拌12 h，挥发有机溶剂后，冷冻干燥得载药粉末。用大量二氯甲烷反复浸泡和淋洗没有负载上的以及黏附在PLCS粉末表面的靛玉红，通过配制标准溶液和绘制标准曲线，用HPLC法检测没有被PLCS负载的靛玉红的质量，根据公式LC=(A-B)/C ［6］ （A=投入靛玉红的总质量; B=没有被负载靛玉红的质量; C=投入PLCS的质量）计算PLCS对靛玉红的载药量。

　　1.4    载靛玉红PLCS纳米胶束在大鼠体内的药动学

　　1．4．1    色谱条件    色谱柱：Angilent Hypersil ODS(4.0 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇?水?乙酸（体积比74∶25∶1）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：287 nm；进样体积：20 μL。

　　1．4．2    给药方案与血样采集与处理    将雄性SD大鼠（约300 g,购自广东省医学实验动物中心，合格证号：粤监证字2007A006）16只，随机分成2组，分别按体质量1.25 mL·100 g-1灌胃0.80 mg·mL-1靛玉红混悬液(精密称取约8 mg靛玉红原料药，加1 mL DMSO充分混匀，加入10%吐温?80溶液0.  5 mL，超声混合，双蒸水定容至10 mL)以及上述纳米胶束水溶液，注射前禁食12 h，可自由饮水。注射给药后分别于0、0.016、0.08、0.16、0.32、0.64、1、2、 4、6、10 h断尾取血0.5 mL置肝素化的离心管中，血样于3 000 r/min离心10 min，上层血浆样品处理方法及含量测定同文献［7］ 。

　　1.5    统计学处理
       
　　实验数据采用SPSS13.0软件进行student’s t检验，比较各组变量间有无差异。
2    结果与讨论

　　2. 1    PLCS的合成与聚合物结构表征
     
　　合成前的原料、反应后的产物N?软脂酰基壳聚糖红外光谱如图1所示，壳聚糖在1 574 cm-1有N?H弯曲振动吸收峰，表明壳聚糖有未被酰化的自由氨基，3 426 cm-1是羟基的吸收峰。当壳聚糖被酰化后，出现了具有明显特征的1 638和1 525 峰，分别对应酰胺的羰基伸缩震动（amide Ⅰ band）和酰胺Ⅱ峰(amide Ⅱ band,即δN?H )。谱图中在1 710～1 760 cm-1没有出现吸收峰，该位置是成酯羰基特征吸收峰，因此可明确判断壳聚糖的羟基没有被酯化，酰基的引入有高度的选择性，反应的位点全部为壳聚糖的氨基。
     
　　图2为PLCS（DS14.2）在DMSO?d6溶剂中的1H?NMR谱图，δ 0.85为接枝的软脂酰基中的甲基氢，δ 1.23为软脂酰基中亚甲基氢，δ 1.49为软脂酰基中羰基的β位亚甲基氢，δ 1.85为软脂酰链中与羰基相邻的α位亚甲基氢，δ 2.08为壳聚糖分子中残余乙酰基中的甲基氢，δ 2.88为壳聚糖葡聚糖环上的H?2，δ 3.20～3.90为葡聚糖环上H?3,4,5,6,6′与水峰重叠。δ 4.86～5.49葡聚糖环上的H?1，δ 8.52为氨基上发活泼氢N?H。1H?NMR谱图表明壳聚糖分子中的氨基发生了酰化反应。壳聚糖酰化取代度可通过1H?NMR谱图中软脂酰基链甲基峰的积分强度与3倍H?2的积分强度的比值估算（δ0.85/3δ2.88）［8］。

　　图1    壳聚糖（a）以及PLCS（DS分别为b.21.6，c.14.2，d.9.5）的FT?IR光谱（略）

　　Figure 1    FT?IR spectra of chitosan(a), PLCS (DS 21.6) (b), PLCS(DS 14.2) (c) and PLCS(DS 9.5) (d)

　　图2    PLCS（DS 14.2）在DMSO?d6溶剂中的1H?NMR谱（略）

　　Figure 2    1H?NMR spectra of PLCS (DS 14.2 ) in DMSO?d6
     
　　激光散射测得PLCS(DS 21.6)粒径为85 nm，PLCS(DS 14.2) 粒径为110 nm，PLCS(DS 9.5) 粒径为140 nm。图3显示胶束粒子的形貌近似球状，粒径在10～50 nm范围，远比由DLSC测得的数值小，产生这种现象的原因是DLSC测出的结果是胶束粒子在水溶液中的流体力学粒径，而TEM呈现的是胶束粒子脱水晾干后的粒径。

　　图3    PLCS（DS 14.2）胶束粒子的透射电镜扫描图（略）

　　Figure 3    TEM of self?aggregates based on PLCS (DS 14.2)

　　2.2    靛玉红PLCS纳米胶束的制备与载药量测定
     
　　所得载药体系为分散良好的暗红色粉末，改变药物与纳米载体的投料比例，获得的靛玉红载药量分别为5.5%、8.2%、13.3%。

　　2.3    载靛玉红PLCS纳米胶束在大鼠体内的药动学
     
　　从载药纳米胶束水溶液（载药量为8.2%）和原料药混悬液在大鼠体内的药动学结果（如图4，表1所示）可见：采用PLCS负载靛玉红制备成纳米胶束后，AUC提高了2.21倍，靛玉红的生物利用度大大提高；载药纳米胶束较原料药混悬剂的Cmax高1.72倍；而且达峰时间Tpeak也有显著性差异(P<0.05)，载药纳米胶束较原料药混悬液略有提前；表明靛玉红制备成PLCS纳米胶束后，其吸收速度和程度都有明显改善。提示PLCS负载靛玉红不仅能提高其水溶性，而且穿透生物膜的能力也得到改善。

　　图4    单剂量腹腔注射靛玉红混悬剂与靛玉红PLCS纳米胶束后的大鼠血药浓度（略）

　　Figure 4    Plasma concentration of indirubin after single intra?peritoneal injection of indirubin suspension and PLCS?loaded indirubin nanomicells in rats

　　表1    大鼠腹腔注射10 mg/kg靛玉红混悬剂与靛玉红PLCS纳米胶束的药动学参数（略）

　　Table 1    Pharmacokinetics of indirubin suspension and PLCS?loaded indirubin nanomicells after intraperitoneal injections at a dose of 10 mg/kg in rat

　　对于难溶性药物来说，溶解是提高其被动扩散的前提（靛玉红的小肠吸收为典型的被动扩散机制），将靛玉红制备成PLCS纳米胶束后，可以提高其水溶性，从而体内血药浓度大大提高，生物利用度也显著增加。提示PLCS可以作为提高难溶性药物靛玉红生物利用度的候选载体，并且有改善靛玉红治疗白血病疗效的潜在可能。

【参考文献】
  　　［1］ 吴正红,周静,平其能,等.靛玉红磷脂复合物的跨膜转运及其犬体内药代动力学［J］.中国药科大学学报,2007,38 (4): 327-331.

　　［2］ 蒋刚彪,冯英,赵慧,等.聚合物纳米粒子作为抗肿瘤药物载体的应用［J］.中草药,2007,38（8):1265-1269.

　　［3］ SIRICA A E,WOODMAN R J. Selective aggregation of L1210 leukaemia cells by the polycation chitosan［J］. J Natl Cancer Inst,1971,47(2): 377-381.

　　［4］ PAE H,SEO W,KIM N,et al. Induction of granulocytic differentiation in acute promyelocytic leukaemia cells(HL?60) by water?soluble chitosan oligomer［J］. Leukemia Res,2001,25(4): 339-346.

　　［5］ HIRANO S,YAMAGUCHI Y,KAMIYA M. Water?soluble N?(n?fatty acyl) chitosans［J］. Macromol Biosci,2003,3(10): 629-631.

　　［6］ GUPTA K C,RAVI KUMAR M N V. PH dependent hydrolysis and drug release behavior of chitosan/poly (ethylene glycol) polymer network microspheres［J］. Material Sci: Materials in Medicine,2001,12(9):753-759.

　　［7］ DENG XY,ZHENG GH,GAO GH,et al. Determination and pharmacokinetic study if indirubin in rat plasma by high?performance liquid chromatography［J］. Phytomed,2008,15(1): 277-283.

　　［8］ NOBLE L,GRAY A I,SADIQ L,et al. A non?covalently cross?linked chitosan based hydrogen［J］. Int J Pharm,1999,192 (2):173-182.