脑缺血再灌注后大鼠IGF1及其受体表达对其神经行为的影响

 作者：孙锋 刘蔚 丁晓洁 王超 郭云良

【摘要】  　　目的 观察医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊 脑缺血再灌注后大鼠胰岛素生长因子?1(IGF?1)及其受体（IGF?1R）表达对其神经行为的影响。方法 成年健康雄性Wistar大鼠28只，应用线栓法经左侧颈外?内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型。应用BEDERSON评分法评价脑缺血再灌注后神经行为功能，免疫组织化学技术检测IGF?1和IGF?1R表达。结果 脑缺血再灌注后各组动物均出现不同程度的神经功能受损，从再灌注3 d开始神经功能逐渐恢复，但至再灌注7 d才有显著性差异。免疫组化检测显示，脑缺血再灌注后脑组织IGF?1和IGF?1R表达区域和时相变化规律基本一致，再灌注12 h～7 d持续高表达，1～3 d达高峰。结论 脑缺血再灌注后IGF?1和IGF?1R的早期表达可能对神经功能恢复有一定的促进作用。 
【关键词】  脑缺血 神经行为功能 胰岛素生长因子 1 胰岛素生长因子 1受体
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effects of insulin?like growth factor (IGF?1) and its receptor (IGF?1R) on neurobehavior after cerebral ischemic reperfusion in rats. Methods A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was made in 28 healthy male adult Wistar rats, the neurobehavior of  these rats was evaluated via Bederson,s score, and expressions of IGF?1 and IGF?1R were determined by immunohistochemical assay. Results All the MCAO/R animals appearred different extent of neurofunctional impairment. Recovery started from the 3rd day after reperfusion, its significant improvement on 7th day. The expressions of IGF?1 and IGF?1R lasted for 12 h-7 days after reperfusion, reached its peak for 1-3 days, which was basically consistent in area and time?phase. Conclusion The early expressions of IGF?1 and IGF?1R might enhance the neurofunctional recovery after cerebral ischemic reperfusion.
    
　　［KEY WORDS］ Brain ischemia; Neurobehavioral function; Insulin?like growth factor 1; Insulin?like growth factor 1 receptor
    
　　胰岛素样生长因子（IGFs）是一类多肽，参与多种生理功能，是机体组织细胞增殖、分化和成熟过程中重要的细胞因子，因其结构与胰岛素前体有高度同源性，且可作用于胰岛素受体而得名。胰岛素生长因子?1(IGF?1)是一种含有70多个氨基酸的碱性肽，可介导生长激素对机体的促生长作用。IGF?1在脑组织中存在，是出生后大脑发育所必需的生长调节因子[1]。研究结果表明，脑缺血后脑内IGF?1 mRNA表达增高，并且游离的IGF?1浓度上升，可能有神经元保护作用[2]。IGF?1的大部分细胞效应是通过 IGF?1受体（IGF?1R）实现的。本实验旨在观察脑缺血再灌注后脑内皮质区和纹状体区IGF?1和IGF?1R表达对大鼠神经行为功能的影响。
　　1  材料与方法
　　1.1  动物模型的建立
    
　　成年健康雄性Wistar大鼠28只，体质量20～260 g，清洁级，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字20021024。随机分为脑缺血1 h再灌注6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d和假手术组，每组4只。应用线栓法经左侧颈外?内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型。模型成功的标志：动物苏醒后出现左侧Horner征、右侧以前肢为重的偏瘫，爬行时向右侧划圈。假手术组除不插线外，其余步骤同实验组。实验中出现呼吸困难、出血过多、死亡以及术后2 h仍不能苏醒的动物弃去不用，并另选动物补足4只。
　　1.2  神经行为功能测试 
　　各组动物分别于脑缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d按BEDERSON评分法评分[3]。
　　1.3  标本的采集和处理
    
　　各组大鼠按规定的再灌注时间点取材，假手术组于术后24 h取材。以100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉动物，用40 g/L甲醛溶液经心脏灌注固定，断头完整取脑，置于40 g/L甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。切取视交叉后方约5 mm的脑组织，常规脱水、透明、石蜡包埋。自视交叉后缘开始连续冠状切片（厚度5 μm），每隔10张抽取1张，贴于多聚赖氨酸处理的玻片上，晾干备用。甲苯胺蓝染色尼氏体呈深蓝色，核染色呈淡蓝色，背景浅淡。
　　1.4  免疫组化染色
    
　　兔抗大鼠IGF?1和IGF?1R单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶连接法（SP）免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。标本切片常规脱蜡、水化，按试剂盒提供的实验步骤操作，DAB显色，光镜下观察，胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。高倍镜下（400倍）在皮质区和纹状体区随机各取4个视野计数阳性细胞，结果以±s表示。
　　1.5  统计学分析
    
　　采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验。
　　2  结果
　　2.1  神经行为功能评分
    
　　假手术组动物神经功能评分均为0分（无神经损伤症状），脑缺血再灌注后各组动物均出现不同程度的神经功能缺损，评分为1～3分。从时间上来看，再灌注6 h～1 d神经功能缺损明显，从再灌注3 d开始，各组动物神经功能逐渐恢复，评分逐渐减少，脑缺血再灌注后7、14 d神经功能评分与再灌注6 h相比较，差异有显著意义（t=5.172、3.846,P<0.05）。见表1。
　　2.2  甲苯胺蓝染色检查
    
　　假手术组脑组织神经细胞形态结构正常、排列均匀，呈卵圆形或多边形，细胞浆尼氏体呈深蓝色，细胞核呈均匀淡蓝色。脑缺血损伤区神经细胞出现核固缩、不规则，细胞周围出现明显的周隙，染色加深呈紫蓝色，核仁消失，并有许多散在的细胞碎片（图1、2）。
　　2.3  IGF?1表达
    
　　假手术组脑组织可见少量着色较浅的IGF?1阳性细胞。缺血再灌注6 h后脑皮质区和纹状体区IGF?1阳性细胞数开始增加（图3），从再灌注12 h～7 d 一直持续高表达，其中以再灌注1～3 d最高，与假手术组比较差异有显著性（t=1.86～9.07,P<0.05）。见表1。

2.4  IGF?1R表达
    
　　假手术组脑组织神经细胞IGF?1R表达较微弱，阳性细胞数量较少，着色较浅。脑缺血后神经细胞IGF?1R表达增强（图4），主要位于皮质区和纹状体区，脑缺血再灌注后6 h神经元即出现IGF?1R的表达，随着再灌注时间的延长逐渐增强，阳性细胞增多，着色加深，再灌注1～3 d达高峰，之后逐渐减弱，至再灌注7 d与假手术组比较均有显著性差异(t=2.60～6.85,P<0.05)。见表1。
　　图1  假手术组脑组织神经细胞形态  甲苯胺蓝染色×400 （略） 
　　图2  脑缺血再灌注（1 d）损伤后神经细胞核固缩  甲苯胺蓝染色×400（略） 
    
　　图3  脑缺血再灌注（12 h）损伤后神经细胞IGF?1表达增强  SP染色×400（略）  
　　图4  脑缺血再灌注（3 d）损伤后神经细胞IGF?1R表达增强  SP染色×400（略）
　　3  讨论
    
　　研究表明，IGF?1作为一种神经营养因子具有多方面的功能，其在脑组织中具有促进神经元和神经胶质细胞分化、增殖和促进脑组织生长、发育的作用。赵仁亮等[4]观察显示，帕金森病人血浆IGF?1水平下降，分析其可能对痴呆病人有神经保护作用。而IGF?1对脑缺血再灌注损伤也有重要的保护作用[2]。在生理状态下，中枢神经系统有广泛的IGF?1免疫反应性和IGF?1mRNA的表达，并发现IGF?1受体在蛋白、mRNA和DNA等不同水平广泛存在于中枢神经系统，IGF?1在正常成熟的脑组织中呈广泛的低水平表达。脑缺血后，IGF?1系统被激活，其在脑组织中的表达和分布均发生明显改变[5]，同时也激活其他保护因子[6]。IGF?1的表达还与损伤程度有关，损伤较轻时，IGF?1仅表达于大脑皮质组织；损伤较重时，弥漫分布于整个受损半球。BEILHARZ等[7]报道，缺血5 h内IGF?1便在缺血侧大脑半球血管内积聚，3 d后IGF?1 mRNA出现在迟发性神经元死亡区被激活的小胶质细胞上，与此同时IGF?1表达也增高，并于5 d达高峰。脑缺血可诱导IGF?1 mRNA在小胶质细胞上的表达，小胶质细胞分泌的IGF?1可显著延缓神经元和星形胶质细胞的损害[8]。SCHEEPENS等[8]在慢性缺血动物模型中发现，缺血后72 h IGF?1 mRNA在受损半球表达明显增加，14 d也明显增加。脑缺血低氧性损伤后2 h给予外源性IGF?1可减少继发性神经元脱失，表明IGF?1可能是一种神经保护物质。本实验结果与上述报道存在一定的差异，可能因各家动物模型种类、缺血时间和实验条件存在差异所致。 
　　表1  大鼠脑缺血再灌注后神经行为功能评分、IGF?1和IGF?1R阳性细胞的观察（略）
　　与再灌注6 h组比较，#t=5.172、3.846, P<0.05；与假手术组比较，*t=1.86～9.07,P<0.05
　　GUAN等[9]在低氧缺血损伤后观察到神经细胞坏死和凋亡，神经细胞表面IGF?1与IGF?1R结合明显处细胞膜完整，从而也揭示IGF?1神经保护作用是通过其受体作用实现的。脑缺血损伤后，IGF?1治疗可以明显缩小脑皮质梗死范围，减少神经元缺失，改善躯体感觉功能[10]。随着损伤的加重，IGF及其受体的合成也增多，促进受损区神经胶质细胞分化增生，通过刺激IGF?1的活性，磷脂酰肌醇?3?激酶（PI3K）被激活，促进神经胶质细胞分化为星型和少突胶质细胞，参与轴突的修复。本实验显示，脑缺血再灌注后神经功能出现明显缺损，由于自身的代偿和保护作用，从再灌注3 d开始有所恢复，至再灌注7 d明显恢复。脑组织IGF?1和IGF?1R表达区域和时相变化规律基本一致，主要在皮质和纹状体区，再灌注12 h～7 d持续高表达，1～3 d达高峰，提示其早期表达对神经功能恢复有一定的作用，但这一作用是有限的，持续时间也较短。因此，及时补充外源性IGF?1可为脑组织提供有效的营养和支持作用，有望成为治疗缺血性脑血管病的有效方法。
【参考文献】
  　　[1]于恺,田沈,孟秀君,等. 胰岛素对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及其相应基因的调控[J]. 中国临床康复, 2004,7(16):2315?2316.
　　[2]DENTI L, BANCHINI A, CAPOROTUNDO S, et al. IGF system in acute ischemic stroke[J]. J Endocrinal Invest, 2002,25(10 Suppl):55?60.

　　[3]GUO Y L, SUN G L, GONG W W, et al. Relationship between growth associated protein and Nogo protein gene expression after cerebral ischemia reperfusion and nervous behavioral function[J]. Chin J Clin Rehab, 2004, 8(25): 5424?5425.

　　[4]赵仁亮,王春霞. 帕金森病非痴呆和痴呆病人血浆IGF?1的变化[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(4):372?374.

　　[5]徐忠信,何金婷,莽靖,等. 局灶性脑缺血及再灌注损伤IGF?1表达的动态变化[J]. 吉林大学学报：医学版, 2005,31(3):401?403.

　　[6]CHAVEZ J C, LAMANNA J C. Activation of hypoxia?indu?cible factor?1 in the rat cerebral cortex after transient global ischemia: potential role of insulin?like growth factor?1[J]. J Neurosci, 2002,22(20):8922?8931.

　　[7]BEIHARZ E J, RUSSO V C, BUTLER G, et al. Co?ordinated and cellular specific induction of the components of the IGF/IGFBP axis in the rat brain following hypoxic?ischemic injury[J]. Brain Res Mol Brain Res, 1998, 59(2):119?134.

　　[8]SCHEEPENS A, SIRIMANNE E S, BREIER B H, et al. Growth hormone as a neuronal rescue factor during recovery from CNS injury[J]. Neuroscience, 2001,104(3):677?687.

　　[9]GUAN J, BBIHARZ E J, SKINNER S J, et al. Intracerebral transportation and celluar localization of insulin?like growth factor1 following central administration to rats with hypoxio?ischemic brain injury[J]. Brain Res, 2000,853(2):163?173.

　　[10]GUAN J, MILLER O T, WAUGH K M, et al. Insulin like growth factor 1 improves somatosensory function and reduces the extent of cortical infarction and ongoing neuronal loss after hypoxia irchemia in rats[J]. Neuroscience, 2001,105(2):299?306.